PREGLED SVIH FINANCIJSKIH I POSLOVNIH TEMA, INTERNET USLUGE Pregled usluga
BESPLATNI PREGLED PRAVNE REGULATIVE
Brzi pregled sadržaja propisa. Projekt je nastao za potrebe poslovnih ljudi koji kontinuirano prate pravnu regulativu kako bi se informirali da li je objavljen neki novi propis koji se odnosi na njihovu djelatnost. Radi brzog pregleda, na ovim stranicama nalazi se sažetak sadržaja, a klikom na link može se pregledati originalni izvor i cijeli sadržaj.
Stranica HR2009-12-150-3665 NN 150/2009

• III.5.2. Ako se tijekom prvih sedam dana inkubacije pojavi citotoksičnost, u toj fazi treba obaviti subkultivaciju i stanice treba inkubirati 14 do 18 dana, nakon čega se ponovno provodi subkultivacija i daljnje inkubiranje tijekom 14 do 18 dana. Ako se citotoksičnost pojavi nakon sedam dana, subkultivacija se obavlja jedanput, a stanice se inkubiraju na način da se postigne ukupno 28 do 36 dana inkubacije od prvobitne inokulacije.

Stranica 2009-12-150-3665 NN 150/2009

• III.5.3. Ukoliko se u primarnoj kulturi pojavi bakterijska kontaminacija, treba ponovno pripremiti test upotrebom homogenata tkiva pohranjenog na – 80 °C. Prije inokulacije, homogenat tkiva se centrifugira pri 4 000 x g kroz 30 minuta na temperaturi 0 do 6 °C, i supernatant se filtrira kroz 0,22 µm. Ukoliko se bakterijska kontaminacija pojavi tijekom faze subkultivacije, supernatant se filtrira kroz 0,22 µm, inokulira u svježe stanice i inkubira daljnjih 14 do 18 dana.

Stranica 2009-12-150-3665 NN 150/2009

• Ako se u bilo kojoj fazi opaze dokazi CPU-a, ili ako je test hemadsorpcije pozitivan, obavlja se identifikacija virusa. Metode izbora za identifikaciju virusa ZAL su IF utvrđene podtočkom III.6.1. ovoga Dijela Dodatka i RT-PCR utvrđene u Dijelu IV. ovoga Dodatka. Ako se smatra da mogu biti prisutni i drugi virusi, preporučuje se izvođenje dodatnih testova za identifikaciju virusa. Ako ti testovi ne omoguće konačnu identifikaciju virusa u roku od tjedan dana, supernatant se mora dostaviti nacionalnom referentnom laboratoriju ili referentnom laboratoriju Zajednice za bolesti riba radi hitne identifikacije.

Stranica 2009-12-150-3665 NN 150/2009

• III.6.1.1. Stanice SHK-1 (pasaža 80 ili manje) ili stanice TO uzgajaju se u mediju L-15 koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma, 2% (v/v) 200 mM L-glutamina i 0,08% (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanola, na pločama s 24 ili 96 jažica, i upotrebljavaju se pri konfluenciji većoj od 50%. Mogu se upotrijebiti i druge stanične linije i hranljive podloge s dokazanom djelotvornošću. Dvjesto dvadeset pet µl supernatanta kulture, za koju se smatra da je zaražena virusom, dodaje se u svaku od dviju jažica, pomiješa se i 225 µl prenosi u dvije sljedeće jažice, pri razrjeđenju 1:5. Dvije dodatne jažice ostavljaju se neinokulirane i služe kao kontrola. Za uzorke iz različitih ribogojilišta koriste se posebne ploče kao i kontrole virusa. Za kontrolu virusa koristi se referentni izolat virusa ZAL.

Internet NN 150/2009
• III.6.1.2. Ploče se inkubiraju na 14 ± 2 °C i mikroskopski pregledavaju tijekom sedam dana. Kada se zapazi rani CPU ili se u roku od sedam dana CPU uopće ne zapazi, sljedeći korak je fiksiranje. U ovoj se fazi jažice ispiru PBS-om i fiksiraju inkubiranjem s 80% acetonom na sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta. Ploče se suše na zraku i odmah obilježavaju, ili se pohranjuju na temperaturi od 0 do 6 °C ne više od 24 sata prije obilježavanja.
Internet stranice NN 150/2009
• III.6.1.3. Umnožene jažice se obilježavaju monoklonskim protutijelom 3H6F8 za virus ZAL ili drugim monoklonskim protutijelom koje ima dokazane učinkovitosti i specifičnosti, razrijeđeni u PBS-u i inkubiranih 30 minuta pri temperaturi od 37 ± 4 °C. Monoklonsko protutijelo se odstranjuje, a ploče se ispiru tri puta 0.05% otopinom Tween 20 u PBS-u. U svaku jažicu se dodaje protu-mišji IgG FITC konjugat razrijeđen u PBS-u, te se inkubira 30 minuta pri temperaturi od 37 ± 4 °C. Opaska: Svaki laboratorij optimizira razrjeđenje različitih serija monoklonskih protutijela i konjugata FITC-a. Antitijelo se odstranjuje a ploče se tri puta ispiru 0.05% otopinom Tween 20 u PBS-u.
Internet stranice NN 150/2009 • III.6.1.4. Jažice treba odmah pregledati upotrebom invertiranog mikroskopa podešenog za fluorescentnu mikroskopiju s prikladnim filterom za ekscitaciju FITC-a. Test se smatra pozitivnim ukoliko se opaze fluorescentne stanice. Da bi test bio valjan, rezultati pozitivne kontrole moraju biti pozitivni, a rezultati negativne kontrole negativni.
Internet stranice NN 150/2009 • IV.1. Ovim odjeljkom opisani su postupci koji su potrebni za amplifikaciju dijela segmenta 8 genoma virusa ZAL pomoću metode PCR, što se može izvoditi na tkivu ribe ili na virusu ZAL u kulturi.
Internet stranice NN 150/2009 • (a) Iz svakog uzorka se odstranjuje RNAlater. U svaku epruvetu se dodaje 1 ml dH2 O obrađene DEPC-om, te se epruvete centrifugiraju pet minuta pri 13 000 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.
Internet stranice NN 150/2009 • (b) Iz svakog uzorka se uklanja supernatant te se svakom uzorku i kontrolnoj epruveti koja sadrži prikladan kontrolni materijal (400 µl dH2 O ili homogenat bubrega riba koje nemaju specificirani uzročnik bolesti) dodaje 800 µl TRIzola (Invitrogen), ili nekog drugog reagensa za koji je dokazano da ima jednaku ili veću učinkovitost. Ako je potrebno, tkivo se cijepa ponovljenim pipetiranjem. Epruvete se inkubiraju pet minuta na sobnoj temperaturi. Svakoj epruveti se doda 160 µl kloroforma te se epruvete tri minute snažno tresu, a zatim petnaest minuta centrifugiraju pri 13 000 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.
LINK - PREGLED SVIH FINANCIJSKIH I POSLOVNIH TEMA, INTERNET USLUGE Pregled
Vijesti NN 150/2009 • (c) Gornji vodeni sloj se uklanja i stavlja u označenu cjevčicu mikrocentrifuge zapremine 1,5 ml koja sadrži 500 µl izopropanola te se zatim epruvete 10 minuta inkubiraju na sobnoj temperaturi, nakon čega se 15 minuta centrifugiraju pri 6 500 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.
Informacije NN 150/2009 • (d) Odstrani se supernatant i talogu RNA se doda 1 ml 75% etanola. Epruvete se zatim pet minuta centrifugiraju pri 6 500 okretaja u minuti na 0 do 6 °C.
Poslovne stranice NN 150/2009 • (e) Odstranjuje se supernatant i epruvete se oko tri minute ostavljaju otvorene kako bi ishlapio preostali etanol. Dodaje se 15 µl dH2 O obrađene DEPC-om kako bi se talog ponovno suspendirao te se po potrebi kratko vrtložno protrese.
Pregledi NN 150/2009 • (f) Za izračunavanje koncentracije RNA i čistoće uzorka koristi se spektrofotometar. Optička gustoća se mjeri pri 260 i 280 nm.
Besplatno NN 150/2009 • (g) RNA koja će se koristiti odmah (isti dan), može se privremeno pohraniti na 0 do 6 °C. RNA koja se neće odmah koristiti pohranjuje se na – 80 °C.
Glasnik NN 150/2009 • (a) Dva µl RNA se razrjeđuju u dH2 O obrađenoj DEPC-om u epruveti mikrocentrifuge od 1,5 ml. Kada je koncentracija RNA uzorka premala da bi se u RT reakciji omogučilo korištenje 2 µg, koristi se najveća moguća količina RNA. Razrijeđena RNA se inkubira 10 minuta na 55 do 60 °C.
Propis NN 150/2009 • (b) Potom se epruvete koje sadrže RNA stavljaju na led, te se dodaju RT reagensi da bi se dobile konačne sljedeće koncentracije: 1 x pufer, 1 mM dNTP, 100 ng nasumičnih heksamera, 20 U RNase inhibitora i 200 U MMLV-RT u ukupnom volumenu od 20 µl.
Propis NN 150/2009 • (d) cDNA se pohranjuje pri temperaturi od 0 do 6 °C dok je potrebno te se što je prije moguće koristi u PCR-u.
Propis NN 150/2009 • (b) Epruvete se stavljaju na pet minuta u termocikler programiran na 94 °C, nakon čega slijedi 35 ciklusa na 94 °C jednu minutu, na 55 °C jednu minutu i na 72 °C jednu minutu, s konačnom inkubacijom na 72 °C u trajanju od pet minuta.
Propis NN 150/2009 • (c) Rezultati PCR-a se ocjenjuju nakon elektroforeze upotrebom 2% agaroznog gela obojenog etidijevim bromidom, uključujući markere veličine duž uzoraka i negativne kontrole iz faza RT-a i PCR-a. Smatra se da je jedan produkt PCR-a od 155 bp indikativan za prisutnost RNA virusa ZAL. Za uzorke koji sadrže jedan dodatan produkt od 310 bp, također se smatra da sadrže RNA virusa ZAL. Uzorci koji daju više produkata PCR-a, uključujući najmanje jedan od približno 155 bp, mogu sadržavati RNA virus ZAL. Oni se mogu dalje istraživati upotrebom DNA probe ili sekvencioniranjem nukleotida.
PRETHODNA STRANICA - SLJEDEĆA IZBOR: Broj 112/04, Broj 96/09, Broj 57/07, Broj 92/05, Broj 11/94, Broj 109/08
LINK - PREGLED SVIH FINANCIJSKIH I POSLOVNIH TEMA ZA PODUZETNIKE Pregled